摘要：目的通过网络药理学预测四君子汤治疗2型糖尿病（T2DM）的主要活性成分和作用靶点，探讨其多成分-多靶点-多通路的潜在作用机制；并选取AMPK信号通路中的InsR、PI3K进行动物实验验证。方法通过中医药系统药理学数据库和分析平台（TCMSP）、文献挖掘和本课题组已有研究收集四君子汤及其4味中药党参、白术、茯苓、甘草的化学成分，经口服生物利用度（OB）、类药性（DL）、半衰期（HL）3个条件筛选得到药物的有效成分，通过SwissTargetPrediction数据库进行有效成分靶点预测；同时从TTD、Drugbank和DisGeNET数据库对T2DM的靶点进行检索及筛选；成分靶点与疾病靶点映射后使用Cytoscape3.2.1软件构建药物有效成分-靶点蛋白相互作用网络，对该网络进行拓扑学分析筛选节点自由度（degree）≥平均自由度的节点得到核心有效成分-核心靶点网络，同时使用String数据库绘制核心靶点蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络；对核心靶点基因利用DAVID数据库进行GO分析和KEGG分析，构建核心有效成分-核心靶点-代谢通路网络图，探讨四君子汤治疗T2DM的潜在作用机制。采用系统对接网站进行相关度前3蛋白对相关度前5成分的分子对接。并进一步采用动物实验进行验证：选取SD大鼠，运用高糖高脂饲料联合小剂量链脲佐菌素（STZ）诱导T2DM模型，5.65g/kg四君子汤ig给药28d，检测各组大鼠的空腹血糖（FBG）及口服葡萄糖耐量（OGTT），RT-PCR法检测AMPK信号通路中InsR、PI3KmRNA的表达量。结果从四君子汤中筛选出个化学成分，涉及治疗T2DM的47个靶点；根据节点自由度≥平均自由度，筛选出核心成分22个，核心靶点27个；GO分析结果表明其涉及血糖稳态、脂肪组织发育的正调控等7个生物过程，涉及类固醇激素受体活化、药物结合等4个分子功能，包括质膜、核常染色质2个细胞组成；KEGG分析结果表明其可能通过AMPK信号通路、PPAR信号通路、胰岛素抵抗等14个信号通路治疗糖尿病。分子对接60%成分具有强烈的结合活性，40%成分具有较强的结合活性。四君子汤可显著改善T2DM大鼠OGTT（P＜0.），同时降低FBG（P＜0.01），显著升高InsR、PI3KmRNA（P＜0.）的表达量，验证了网络药理学的部分预测结果。结论四君子汤通过多靶点、多通路治疗T2DM，为其分子机制的研究奠定一定的基础。
2型糖尿病（T2DM）是一种由于胰岛素抵抗引起的，以慢性高血糖为特征的代谢性疾病[1]。随着人类社会的进步，工作、生活方式与节奏的改变，T2DM已经成为现代常见病、高发病，此外随着人口老龄化程度日趋加深，胰岛分泌功能衰退，老年人患糖尿病的概率更大。年国际糖尿病联合会（IDF）统计，全球约有3.87亿糖尿病患者，预计年患病人数将高达5.92亿[2]。据世界卫生组织统计，糖尿病并发症高达多种，是目前已知并发症最多的一种疾病，可导致大血管、微血管受损并危及心、脑、肾、周围神经、眼睛、足等，严重危害健康。
糖尿病自古有之，中医谓之“消渴”，消渴的发病与脾胃关系密切[3]。对于脾虚与消渴病的关系，早在《黄帝内经》时期就有详细的论述，《灵枢?本脏》指出“脾脆则善病消瘅易伤”，明确提出脾气虚弱是发生消瘅的重要原因[4]，后世医家王叔和、赵献可等名家的论述均表明脾气亏虚是糖尿病的重要病机。
四君子汤是健脾益气经方，始载于《太平惠民和剂局方》，由人参、白术、茯苓、甘草组成。党参性平，益气健脾不弱人参，若非大补元气，临床常以党参代人参。清?鲍相璈《验方新编》中加味四君子汤即以党参代人参[5]，《中国药典》年版四君子丸及四君子颗粒均以党参代人参[6]。方中党参为君，甘温益气、健脾益肺；臣以苦温之白术，健脾燥湿，加强益气助运之力；佐以甘淡茯苓，健脾渗湿，苓术相配，则健脾祛湿之功益著；使以炙甘草，益气和中，调和诸药。四药配伍，共奏益气健脾之功效，文献报道[7-8]四君子汤及其加味临床可用于治疗糖尿病，同时报道了四君子汤降糖作用，但四君子汤治疗T2DM的机制未见报道。
本课题组前期研究结果表明四君子汤的主要化学成分包括黄酮类、皂苷类、香豆素类、萜类、烯醇类、多糖类、氨基酸类等，并通过实验验证了四君子汤调节T2DM大鼠胰岛素抵抗的作用及改善T2DM大鼠脂代谢紊乱作用。为了发现四君子汤调节T2DM的分子机制，利用网络药理学技术建立“成分-疾病-通路”网络[9]，并对筛选的主要靶点进行实验验证，以期为四君子汤治疗T2DM的作用机制研究提供一定的理论依据。
1材料
1.1药材、药品与试剂
党参（批号）为桔梗科植物党参Codonopsispilosula(Franch.)Nannf.的根，茯苓（批号）为多孔菌科真菌茯苓Poriacocos(Schw.)Wolf的干燥菌核，白术（批号）为菊科植物白术AtractylodesmacrocephalaKoidz.的干燥根茎，甘草（批号）为豆科植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch.的干燥根及根茎，以上药材均购自山西维康堂中药饮片有限公司，经山西中医药大学段秀俊副教授鉴定为正品。链脲佐菌素（STZ，批号S）购于美国Sigma公司；RNAisoPLUS试剂盒（批号AIA）、PrimeScriptTMRTreagentKitwithgDNAEraser（PerfectRealTime）试剂盒（批号AIA）、TBGreenTMPremixExTaqII（TliRNaseHPLUS）试剂盒（批号AIA）均购自TaKaRa公司；无水乙醇、异丙醇、三氯甲烷、柠檬酸以及柠檬酸钠购自天津市光复科技发展有限公司；葡萄糖（批号）购自天津市大茂化学试剂厂。
1.2动物
8周龄雄性SD大鼠，SPF级，体质量（.9±5.3）g，购自中国医学科学院实验动物中心，许可证号SCXK（军）-。
1.3仪器
三诺安稳血糖仪（产品注册证编号24000323，三诺生物传感股份有限公司）；TGL18M型离心机（湖南湘立科学仪器有限公司）；HH-6型水浴锅（上海乔跃电子有限公司）；?80℃超低温冰箱（中科美菱低温科技有限责任公司）；SW-CJ-2FD超净工作台（苏净集团安泰公司）；BeadRuptor12多样品研磨珠均质仪（Omni公司）；StepOnePlus荧光定量PCR仪（ABI公司）；ThermoNanoDrop超微量核酸蛋白检测仪（美国ThermoScientific公司）；移液枪（上海盛创医疗器械有限公司台州分公司）。
2方法
2.1网络药理学分析
2.1.1四君子汤化学成分筛选及作用靶点预测以四君子汤的化学成分为研究对象，整合课题组前期四君子汤实验研究及查阅相关文献资料[10-11]，同时用中药系统药理数据库和分析平台（TCMSP）（
本文编辑：佚名
转载请注明出地址 http://www.dafupi.com/pzff/6999.html
